胶质瘤是核心系统最常见的原发肿瘤，呈浸润性滋长，其中恶性胶质瘤具有术后容易复发，预后差等特色，于今仍贫寒格外灵验的治疗圭臬[1]。替莫唑胺(TMZ)是现在首选化疗药物，天然能改善胶质瘤患者的生计期间及生活质地，但其疗效仍不可令东谈主惬意[2]。连年来有计划发现三环类抗抑郁药氯丙咪嗪不错拦截肿瘤细胞耗氧量ai换脸，增多Caspase-3活性，裁减线粒体膜电位，增多细胞凋一火[3， 4]。咱们在体外有计划中发现氯丙咪嗪或者显然拦截胶质瘤U251细胞增殖，促进凋一火，这如故过不错被18×103转位分子卵白(translocator protein，TSPO)配体PK11195阻断，教导氯丙咪嗪作用靶点是TSPO，可能是TSPO的配体，具有活化TSPO，启动线粒体凋一火门道的作用[5]。氯丙咪嗪为临床常用药，反作用小，或者透过血脑障蔽，在脑组织内的浓度高，半衰期长，是比较理念念的抗胶质瘤候选药物，具有细致无比的行使远景。可是，氯丙咪嗪作用机制仍未格外明确，且试验多为体外有计划完结，贫穷体内有计划把柄。本有计划通过建立东谈主U87胶质瘤肿瘤模子，以氯丙咪嗪为措跻身分，旨在匡助细目氯丙咪嗪在体内复杂环境下对胶质瘤的作用，以期为胶质瘤治疗寻找到新的标的。

1 材料与圭臬 1.1 主要试剂

DMEM高糖培养基、氯丙咪嗪、TMZ购于好意思国Gibco公司；TSPO抗体购于好意思国Abnova公司；Cytochrome C抗体、Caspase-3抗体购于好意思国Santa Cruz公司；羊抗鼠IgG(二抗)购于Miltenyi公司；抗鼠 ABC试剂盒购于DAKO公司；DAB 显色试剂盒购于北京中杉生物工夫有限公司。

1.2 试验细胞和动物

东谈主脑胶质瘤U87细胞株，由中国科学院上海细胞生物学有计划所提供。BALB/c(nu/nu)裸小鼠40只，牝牡参半，周龄4~5周，体质地15~22 g，购自扬州大学比较医学中心，饲养于江苏大学试验动物中心无特定病原体(SPF)要求下。

1.3 裸鼠皮下移植瘤模子的建立

胶质瘤细胞U87细胞悬液0.2 mL(5×106个细胞，台盼蓝染色法细目细胞存活率90%以上)，打针于BALB/c裸小鼠右侧腋窝皮下。每隔3 d用游标卡尺测量肿瘤的最大长径(a)和与其垂直的最大短径(b)，按公式V=ab2/2计较肿瘤体积，待肿瘤滋长达到200 mm3 后，肿瘤模子建立生效。

1.4 分组及给药

根据药典中氯丙咪嗪东谈主用剂量，推算出裸小鼠使用剂量，确立3个剂量组，离别为20、40、60 mg/kg。将30只肿瘤模子裸鼠分红5组，每组各6只，牝牡参半，离别为肿瘤模子组、TMZ组、氯丙咪嗪组(3个剂量组)。给药如下：①氯丙咪嗪组：融解于0.9%生理盐水中，腹腔打针，剂量离别为20、40、60 mg/(kg·d)，伙同给药14 d。②TMZ组：融解于0.9%生理盐水中，腹腔打针，剂量为50 mg/(kg·d)，伙同给药5 d。③肿瘤模子组：等量生理盐水，腹腔打针，1次/d，伙同14 d。

1.5 不雅察药物对肿瘤滋长的影响

从给药之日起，隔3 d测量1次肿瘤体积和荷瘤鼠体质地，记载荷瘤鼠示寂情况，以肿瘤模子组的裸小鼠一皆示寂为试验绝顶，颈椎脱臼法正法其余各组剩余裸鼠，试验经过中示寂裸鼠暂时圆善保存于-80 ℃低温雪柜，待试验拒绝时与其他正法的裸鼠同期分离肿瘤组织后放入-80 ℃低温雪柜保存备用。

1.6 免疫组织化学染色

肿瘤组织制成石蜡切片，脱蜡水化，漂洗，抗原确立，3％H2O2灭活内源性过氧化物酶，滴加一抗，离别为小鼠抗东谈主TSPO、Cytochrome C、Caspase-3抗体，阴性对照滴加PBS缓冲液，滴加含DAB二抗，苏木精复染，脱水，透明，干燥，封片。

完结判断：TSPO以显微镜细胞膜出现棕黄色染色为阳性。Cytochrome C以细胞质出现棕黄色染色为阳性。Caspase-3以细胞质内出现棕黄色染色为阳性。低倍和高倍镜下不雅察ai换脸，就地遴荐10个高倍(×400)视线，计较出平均阳性细胞数和平均细胞总和。阳性细胞率=平均阳性细胞数/平均细胞总和。

1.7 Western blot

卵白裂解液索求肿瘤组织总卵白，12%SDS-PAGE胶电泳分离。电泳结束后，周折至PVDF膜上，5%脱脂奶粉的TBST室温封锁，加入小鼠抗东谈主TSPO抗体(1 ∶500 稀释)、Cytochrome C抗体(1 ∶500稀释)、Caspase-3抗体(1 ∶500稀释)，4 ℃孵育。TBST洗膜后二抗室温下杂交，ECL法显影发光。以β-actin为内参(1 ∶1 000稀释)，接管凝胶成像分析系统进行卵白条带光密度的半定量测定。

1.8 统计学措置

试验数据用±s示意，统计软件使用SPSS 20.0，各组数据经方差皆性纯属，适应方差皆性。组间比较接管独身分方差分析，两组数据比较，接管孤苦样本t纯属。纯属水准α=0.05。

草榴论坛 2 完结 2.1 荷瘤鼠生计期间的比较

肿瘤模子组荷瘤鼠示寂后，比较各措置组与肿瘤模子组荷瘤鼠生计率，氯丙咪嗪各剂量组与肿瘤模子组比较，不可显然增多荷瘤鼠生计率，其中TMZ组仍有4只存活，CIMP 40组和CIMP 20组各有1只存活，而CIMP 60组无存活荷瘤鼠。

2.2 荷瘤鼠移植瘤的滋长情况及瘤体积的变化趋势

东谈主胶质瘤母细胞U87细胞(5×106/mL)接种BALB/c裸鼠34只，移植瘤生遵守90%，成瘤期间(6±3)d，当肿瘤体积达到200 mm3时，将荷瘤鼠分红5组，驱动给药，跟着肿瘤冉冉增大及化疗药物使用，各组荷瘤鼠摄食均出现减少，行为冉冉迟缓，精神气象变差，体质地舒缓。后期出现肿瘤恶病质进展。待肿瘤模子组荷瘤鼠示寂后，颈椎脱臼法正法其他各组荷瘤鼠，剖解荷瘤鼠，肉眼见肿瘤滋长于皮下，包膜圆善，无显然辽阔周折浸润，切面灰白色，中心有干酪样坏死，未见出血(图 1A)。给药初期各组荷瘤鼠移植瘤体积都冉冉增大，但氯丙咪嗪组与对照组比拟较增长较安稳。用药完结后，肿瘤体积有显然增长趋势，且肿瘤模子组移植瘤增长趋势较显然，而TMZ组移植瘤增长较肿瘤模子组安稳(图 1B)。

用药完结后第14天氯丙咪嗪各剂量组(除CIMP 60组)肿瘤体积的增长与肿瘤模子组比拟无统计学各异(P>0.05)，氯丙咪嗪各剂量组(除CIMP 60组)肿瘤体积增长均大于TMZ组(P < 0.05)，氯丙咪嗪各剂量组之间比较无统计学各异(P>0.05，表 1)。

2.3 移植瘤中TSPO卵白抒发的更正

免疫组化染色完结知道，各组肿瘤细胞都有TSPO抒发，其中CIMP 60组阳性细胞率高于肿瘤模子组，各氯丙咪嗪剂量组之间无显然各异(图 2)。

Western blot检测完结知道，CIMP 60组TSPO的抒发较肿瘤模子组增多(P＜0.05)，各剂量组之间无统计学各异(P>0.05，图 3)。

2.4 Cytochrome C卵白抒发的更正

免疫组化染色完结知道，Cytochrome C在各组均有阳性细胞抒发，CIMP 60组阳性细胞率较肿瘤模子组增多(图 4)。

Western blot检测完结知道，Cytochrome C在CIMP 60组的抒发较肿瘤模子组显然增高(P < 0.05)，但各剂量组之间无统计学各异(P>0.05，图 5)。

2.5 Caspase-3 卵白的抒发

免疫组化染色完结知道，Caspase-3在各组均有抒发，CIMP 60组阳性细胞率与肿瘤模子组比较无显然各异(图 6)。

Western blot检测完结知道，Caspase-3卵白在氯丙咪嗪各剂量组与肿瘤模子组间抒发量无统计学各异(P>0.05)，氯丙咪嗪各剂量组间也无统计学各异(P>0.05，图 7)。

3 盘问

氯丙咪嗪是一种高亲脂性三环类抗抑郁药，或者径直通过血脑障蔽参加任何一个脑区，且半衰期较长，能在脑内保管较高的血药浓度，在近几十年的临床行使中尚未发现存颠倒的不良反映[6]。天然氯丙咪嗪不是一个成例抗肿瘤药物，但联系有计划已经阐发氯丙咪嗪有拦截肿瘤细胞滋长的作用[7， 8]。Beaney等[9]在将氯丙咪嗪用于27例恶性胶质瘤患者长达4.5年的临床治疗中发现存21例患者赢得了细致无比的局部反映，讲解氯丙咪嗪在特定的剂量和合适的期间下使用能对胶质瘤患者有潜在的保护作用。本有计划通过建立U87胶质瘤皮下肿瘤模子，有计划氯丙咪嗪在体内对胶质瘤细胞增殖影响及可能存在的机制，完结知道，氯丙咪嗪组的肿瘤体积比拟肿瘤模子组天然无显然统计学各异，但其拦截肿瘤滋长趋势显然。这可能与样本量确立不及磋磨，且无法排斥饮食、性别、个体各异，裸鼠耐受性等多种身分对完结的影响。而在进一步试验有计划中需增多样本量，减少外界非措跻身分等影响，使试验完结更真正、可靠。另外，本有计划发现荷瘤鼠氯丙咪嗪组比拟肿瘤模子组其对肿瘤滋长有拦截趋势，并且高剂量组(60 mg/kg)作用更显然。本有计划以为氯丙咪嗪捏续高剂量使用天然有增多荷瘤鼠示寂率可能，但其对肿瘤拦截趋势较低剂量组显然。天然氯丙咪嗪低剂量组较肿瘤模子组也有拦截肿瘤滋长趋势，但不显然增多荷瘤鼠示寂率(P>0.05)，而住手措置后肿瘤滋长显然加速，有计划完结教导遴荐合适的剂量，永远使用氯丙咪嗪可能具有拦截肿瘤滋长，延迟荷瘤鼠生计期间的作用。

在体内试验有计划中，咱们发现氯丙咪嗪可能通过与线粒体膜上的TSPO伙同，增强其活性，并启动线粒体凋一火门道，促进Cytochrome C的生成和开释，激活Caspase-3，疏通了肿瘤细胞凋一火。而在其他氯丙咪嗪联系有计划中，Daley等[10]也发现比拟对照组而言，使用氯丙咪嗪措置后的恶性胶质瘤细胞中Caspase-3抒发显然增多，肿瘤细胞滋长拦截显然。雷同有计划也发现将氯丙咪嗪作用于小鼠胶质瘤C6细胞后线粒体膜电位下跌，Caspase-3含量增多，肿瘤细胞凋一火风光显然[11]。上述有计划标明氯丙咪嗪的抗肿瘤作用与线粒体凋一火门道有密切关系。一样在本有计划完结发现 60 mg/kg 氯丙咪嗪组胶质瘤细胞中TSPO、Cytochrome C 抒发较肿瘤模子组各异显然，而TSPO、Cytochrome C、Caspase-3的抒发也随药物浓度呈增长趋势，并与体外有计划的完结相符，教导氯丙咪嗪可能通过增强TSPO的活性，启动肿瘤细胞线粒体凋一火门道，促进Cytochrome C开释，激活细胞凋一火联级反映，促使肿瘤细胞凋一火，达到拦截肿瘤滋长作用。

天然本有计划完结教导氯丙咪嗪对胶质瘤滋长莫得显然的拦截作用，但有延迟荷瘤鼠生计期间的趋势，而在进一步试验发现氯丙咪嗪可行为TSPO的抖擞性配体，能通过与作用靶点TSPO伙同后使其抒发增多，从而使肿瘤细胞内凋一火联系卵白抒发增多、ROS开释增多、ATP生成减少，促使线粒体膜电位下跌、线粒体通透性增多，导致线粒体功能受损，最终有疏通肿瘤细胞凋一火可能，但其作用成果并不显然。本有计划不仅分析了氯丙咪嗪对胶质瘤细胞可能作用机制ai换脸，并且斟酌了氯丙咪嗪可能作用靶点TSPO在其抗肿瘤作用中融会的功能，尝试为胶质瘤治疗找到新的圭臬。现在对于氯丙咪嗪抗肿瘤作用的有计划仍方兴未已，而在行使于抗肿瘤临床药物前仍需要多数的基础与临床有计划考据，但氯丙咪嗪为更低价及低毒性的胶质瘤临床治疗提供了新标的，且具有很好的行使远景，为繁多胶质瘤患者带来了新的但愿。